Evolución del diagnóstico de virus y viroides en cultivos comerciales de Solanáceas en Colombia. Una revisión sistemática.

Lorena Mayorga Carrillo¹, Andrea V. Mayorga López¹,Ligia C. Sánchez Leal².

¹Estudiantes del Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

²Profesor de Planta Tiempo Completo, Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.

Resumen

La familia Solanaceae es una de las más abundantes en Colombia, considerada de los primeros eslabones en la agricultura del país, representando alrededor del 15.1% de la flora colombiana con presencia en regiones como Andina, Amazonia, Chocó, Orinoquia, Caribe y Páramo. Debido a su amplia distribución, es afectada por diversos fitopatógenos como bacterias, hongos, oomicetes, insectos y artrópodos, estos últimos son vectores de virus y viroides, los cuales representan pérdidas económicas importantes de estos cultivos. Por esta razón, es importante conocer las diferentes técnicas de diagnóstico y su evolución, el cómo han sido implementadas a lo largo de las últimas décadas para la detección de estos microorganismos. Materiales y métodos: se realizó una revisión sistemática en dos límites de tiempo de veinte años, en conjunto con criterios de inclusión y exclusión con el objetivo de sintetizar la información necesaria para el estudio. Resultados: se evidenció que en el primer límite de tiempo las técnicas de detección en el país eran serología y aislamiento de material genético por PCR, mientras que, en el segundo límite de tiempo, se ampliaron las técnicas desde PCR hasta pirosecuenciación.

Palabras clave: Virus, Viroides, Diagnóstico, Fitopatógenos, Solanáceas.

Introducción

La familia Solanaceae de distribución cosmopolita, incluyendo cerca de 100 géneros y más de 2723 especies para Colombia 32 géneros, con 405 especies, se encuentra representada con el 15.1% de la flora colombiana distribuidas en la región andina, amazonia, Chocó, Orinoquia, Caribe y páramo (Reyes 2018). Es considerada entre los primeros eslabones en la agricultura, debido a que tiene plantas de importancia económica y porque, además, constituyen elementos básicos de la canasta familiar; en Colombia, se producen: el tomate de mesa (Solanum lycopersicum Lam.), el tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.), el lulo (Solanum quitoense Lam.), la berenjena (Solanum melongena L.), el pimentón (Capsicum annuum L.), el ají (Capsicum sp.), el tabaco (Nicotiana tabacum) y la uchuva (Physalis peruviana), como principales cultivos (Gallo García 2020). Al ser tan amplia la variedad de esta familia y ser cultivos de producción masiva, es afectada por diversos fitopatógenos como bacterias (Ralstonia solanacearum), hongos (Alternaria solani, Puccinia sp.) entre los más aislados en el país (Carreño et al. 2007; Yepes et al. 2019). Seguido por Oomicetes (Phytophthora infestans) e insectos plaga como Neoleucinodes elegantalis, Bemisia tabaci, los cuales son vectores de otros microorganismos como virus, viroides, virusoides y fitoplasmas (Cuellar & Morales 2006; Díaz et al. 2011).

Las investigaciones en el campo agroindustrial son de gran importancia para la prevención de enfermedades que afectan los cultivos de plantas que se producen en magnitudes considerables y podrían traer consecuencias para la futura producción de alimentos, su calidad, distribución y seguridad. Dentro de los microorganismos más relevantes y menos estudiados se encuentran los virus en plantas, los cuales son una de las principales causas de la afectación de la producción de alimento alrededor del mundo, reduciendo la calidad de los cultivos lo que conlleva a un impacto económico estimado de más de 30 billones de dólares por año (Trebicki 2020), aunque las pérdidas producidas por estos microorganismos no están muy bien documentadas dependiendo de su género, especie, la frecuencia con la que generan patologías y el tipo de cultivos que afecta.

Los virus de las plantas son considerados como parásitos obligados dependientes de la maquinaria de replicación de una célula hospedera, la invaden a través de una herida superficial en la pared celular, a menudo acelerada por insectos transmisores, y liberan rápidamente su genoma para la traducción de sus propias proteínas (Naitow et al. 2020), estos se encuentran formados por dos partes principales: el genoma compuesto de ácido nucleico, y una cubierta proteica, la cual protege la partícula viral aunque adicionalmente algunos virus están recubiertos por una membrana externa compuesta de lípidos y proteínas denominada membrana. Su clasificación se atribuye a características en las que difieren los virus, como su cápside, la cual puede ser helicoidal o icosaédrica según la simetría del ensamblaje de las proteínas que la conforman donde el ácido nucleico toma la misma conformación. Otra manera de clasificarlos, es según el tipo de material genético que puede ser ADN de cadena doble (ADNcd), ADN de cadena simple (ADNcs), ARN de cadena simple (ARNcs) que consisten en polaridad de sentido positivo como el de la célula hospedera o bien, de sentido negativo (Gergerich & Dolja 2021).

Incluso con menos frecuencia se estudian los viroides, estos son las partículas infecciosas más simples descritas hasta el momento con cadenas de ARN de aproximadamente 250 a 400 nucleótidos con una alta complementariedad interna (Soto et al. 2008), que no codifican para proteínas ni lípidos porque carecen de marcos de lectura abiertos y debido a esto dependen completamente del hospedero. Estas partículas son capaces de replicarse autónomamente en plantas e inducir enfermedades de importancia económica como en cultivos comerciales, es por esta razón la importancia del surgimiento de nuevas investigaciones para aportar al sector agrícola y económico. Teniendo en cuenta que estas pequeñas partículas llamadas viroides no poseen los mecanismos necesarios para codificar sus propias proteínas, ellos suelen recurrir a utilizar la maquinaria transcripcional del núcleo o de los cloroplastos para su replicación, movimiento y patogénesis. Los viroides se adaptan a una u otra familia según la forma que adoptan; se asignan a la familia Pospiviroidae si adoptan una estructura secundaria en forma de varilla termodinámicamente estable con una “región central conservada” (CCR) y no se escinden por sí mismos o por otra parte se asignan a la familia Avsunviroidae si son ARN catalíticos que se autoescinden a través de ribozimas de cabeza de martillo durante la replicación (Eiras et al. 2009).

Por esta razón, durante las últimas décadas, se han establecido métodos tradicionales y modernos para detectar virus y viroides, que afectan tanto a humanos, animales como también a plantas; estos métodos incluyen revisión de la sintomatología, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), hibridación molecular, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), secuenciación profunda de ARN (RNA-Seq), caracterizaciones moleculares y pirosecuenciación, con énfasis en el desarrollo de técnicas que permitan tener resultados basados en la confiabilidad, sensibilidad, menor consumo de tiempo y bajo costo (Menzel et al. 2003). El objetivo de este artículo fue hacer una revisión documental sistémica en dos límites de tiempo de veinte años, específicamente de 1981 a 2000 y del 2001 al 2020, donde se comparó la evolución en cuanto a los métodos de diagnóstico implementados en el país para aislar y diagnosticar infecciones causadas por agentes como virus y viroides en cultivos de Solanáceas en Colombia, con el fin de ampliar la perspectiva de fitopatógenos que afectan esta familia de plantas a lo largo del tiempo.

Materiales y métodos

Esta revisión sistemática se realizó con los protocolos establecidos por los elementos de informes preferidos para revisiones sistemáticas (PRISMA). Se realizaron búsquedas en bases de datos como Biblioteca Agropecuaria de Colombia (BAC), Google académico, PubMed, Repositorios de universidades establecidas en el territorio nacional tales como Universidad Nacional de Colombia, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca y la Universidad Militar Nueva Granada, Researchgate, SciELO y Sciencedirect tomando como partida la pregunta “¿Cuál ha sido la evolución del diagnóstico de virus y viroides en cultivos comerciales de Solanáceas en Colombia?”, tomando estudios relacionados con la presencia y clasificación de estos. Además, se realizaron búsquedas manuales en las listas de referencias de los artículos seleccionados y de las revisiones anteriores para identificar cualquier otra publicación relevante.

Criterios de inclusión

Elegibilidad. Para iniciar la búsqueda en la literatura científica se incluyeron estudios de cualquier diseño y en cualquier idioma que abordan directamente cualquier punto de la investigación.

Palabras clave. Uso de diferentes palabras clave como: “solanáceas”, “virus”, “viroides”, “Principales cultivos agrícolas en Colombia”, “viroides en solanáceas”, “Viroides reportados en Colombia”, “Diagnóstico de virus en solanáceas”, “virus en solanáceas”, “Virus reportados en Colombia”, “Diagnóstico de viroides en solanáceas”

Idioma y tipo de literatura. Se seleccionaron e incluyeron artículos de revisión, artículos de investigación, monografías y tesis en español, inglés y portugués.

Extracción de datos. De cada publicación extrajimos datos sobre tipo de virus/viroide, localización del estudio, tipo de estudio, año de publicación, presencia de las palabras clave en el resumen, diseño del estudio, población de estudio (tipos de cultivos), descripción y evaluación de resultados.

Criterios de exclusión.

Año de estudio. Para analizar la evolución que ha tenido el diagnóstico de este tipo de fitopatógenos y la importancia que ha tomado este campo de estudio a lo largo de los años se realizaron dos clasificaciones de publicaciones, la primera desde el año 1981 a 2000 y otra del año 2001 a 2020.

Publicaciones repetidas. Según el título y por medio de una base de datos se excluyeron las publicaciones repetidas o similares con la misma población de estudio que no fueron relevantes en el análisis del tema.

Selección de estudio. Se realizó una primera selección de artículos con base en su título y

resumen. Luego, se recuperaron y examinaron los textos completos de los artículos seleccionados para excluir:

Publicaciones que no sean entre los años 1981 hasta 2020.

Publicaciones que no se refirieron ni a virus ni a viroides solanáceas en Colombia.

Publicaciones no relacionadas con enfermedades en cultivos.

Publicaciones que no incluyeran métodos diagnósticos para detección de virus y viroides.

Publicaciones que incluyan cultivos que no pertenezcan a la familia Solanaceae.

Resultados y discusión

Resultados de la búsqueda de estudios

La aplicación del protocolo de búsqueda a través de las rutas descritas previamente, cuyas diferentes etapas pueden observarse en la Figura 1 y 2, dio como resultado un total de 189 artículos publicados en el rango de años comprendido entre 1981 y 2020. Tras la eliminación de duplicados, la aplicación de criterios de inclusión y exclusión, quedaron un total de 3 publicaciones realizadas que incluyan el diagnóstico de virus y viroides en cultivos de Solanáceas para el primer periodo de tiempo estudiado; mientras que para el segundo periodo de tiempo quedaron un total de 25 publicaciones que fueron incluidas en la revisión sistemática.

Figura 1. Esquema del protocolo de búsqueda para el primer periodo de tiempo comprendido entre 1981 hasta 2000.

Figura 2. Esquema del protocolo de búsqueda para el segundo periodo de tiempo comprendido entre 2001 hasta 2020.

La revisión sistemática presentó limitaciones en la búsqueda de artículos para el primer periodo del estudio, esto debido a que debido a los años de publicación la mayoría de estos estudios se encontraban en colecciones impresas sin ser digitalizadas.

Metodologías diagnósticas

Son diversos métodos empleados para la detección de los microorganismos objetos de este estudio que han evolucionado para suplir la necesidad de identificar el agente patógeno responsable de pérdidas económicas a nivel agroindustrial. Cada proceso de identificación de una enfermedad viral requiere la información más completa posible sobre las características genéticas del cultivo, las condiciones ambientales en que se desarrolla, las prácticas culturales utilizadas y el agente viral que puede estar interfiriendo en con el desarrollo normal de las plantas (Álvarez Restrepo 2010).

El diagnóstico molecular con el paso del tiempo y sus valiosos descubrimientos han aportado significativamente a la investigación y a la lucha contra las enfermedades infecciosas donde se ha hecho necesaria la optimización de la especificidad, sensibilidad y rapidez de dichas técnicas (Angarita Merchán et al. 2017). En el primer periodo de tiempo se encontraron registradas tres técnicas diagnósticas: Serología (50%), Reacción de la cadena polimerasa (25%) y Electroforesis (25%) (Figura 3). Mientras que en el segundo periodo de tiempo se observa un incremento en la cantidad de técnicas disponibles y utilizadas para la detección de virus que afectan los cultivos de solanáceas: Reacción de la cadena polimerasa cuantitativa (RT-PCR) (20%), serología (16%), secuenciación de nueva generación (NGS) (13%), reacción de la cadena polimerasa (PCR) (11%), reacción de la cadena polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) (10%), análisis bioinformáticos (8%), análisis filogenético (7%), microscopía electrónica (3%), secuenciación de alto rendimiento (HTS) (3%), secuenciación Sanger (3%), técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) (2%), hibridación de ácidos nucleicos (2%) y pirosecuenciación (2%) (Figura 4).

Figura 3. Frecuencia en la que se realiza cada método diagnóstico para virus y viroides en el primer periodo de tiempo comprendido entre 1981 hasta 2000 según los artículos analizados.

En el primer periodo de tiempo se reporta la electroforesis como método diagnóstico ya que es usada para el análisis de RNAs del potato spindle tuber viroid (PSTV) extraídas de Lycopesium esculentum (Blanco Valbuena 1982), como es estudio fue realizado en 1982 no estaba disponible a la fecha los ensayos con PCR los cuales fueron desarrollados desde 1983 por Kary Mullis (Mullis 1990), sin embargo en el segundo periodo de tiempo no se describe como metodología diagnóstica ya que hace parte del proceso de lectura de los diferentes tipos de PCR implementadas para la detección del material genético viral en cultivos de solanáceas.

Figura 4. Frecuencia en la que se realiza cada método diagnóstico para virus y viroides en el segundo periodo de tiempo comprendido entre 2001 hasta 2020 según los artículos analizados. RT-PCR: Reacción de la cadena polimerasa cuantitativa; NSG: Secuenciación de nueva generación; PCR: Reacción de la cadena polimerasa; RT-qPCR: Reacción de la cadena polimerasa cuantitativa de transcripción inversa; HTS: Secuenciación de alto rendimiento; RFLP: Técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción.

En la figura 1 se observa que, durante el primer periodo estudiado, el diagnóstico de las enfermedades virales ha sido bastante limitado desde su descubrimiento donde aproximadamente para el año 1974 se realizan unos de los primeros estudios y publicaciones para demostrar tanto la existencia de viroides como de sus propiedades biológicas y se introduce este nuevo término a la virología (Diener 1974).

Otros estudios en Latino América demuestran que se han implementado metodologías diagnósticas en solanáceas, en el año 2005 en Guatemala, El Salvador, Honduras y Nicaragua, se hizo un análisis visual de los síntomas y PCR a cultivos de Lycopersicum esculentum que dieron positivo a la infección por Geminivirus (Toruño Calero and Roca 2005), en Ecuador se realizó el secuenciamiento de siRNA para la detección del Virus Y de la papa (PVY) infectando Solanum spp. en Perú en el 2013 (Flores et al. 2013), en el mismo país en el 2017 se detectó el virus X de la papa (PVX), el virus Y de la papa (PVY), el virus del mosaico de la alfalfa (AMV), y el virus de la clorosis infecciosa del tomate (TiCV) infectando en Solanum betaceum utilizando sondas de ARN de hibridación no radiactivas (Pérez Hernández 2017), dos años después en el 2019 se utilizó otras metodologías diagnósticas como serología por el kit DAS-ELISA y RT-qPCR aislando Potato virus X (PVX) en Physalis peruviana en la provincia de Imbabura, Ecuador (Andrade Beltrán 2019), en México en 2019 se hizo el primer reporte de Cucumber mosaic virus (CMV) en Solanum lycopersicum mediante RT-PCR, secuenciación de DNA y su análisis filogenético (Valadez-Ramírez et al. 2019) y el primer reporte de Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) infectando Solanum lycopersicum detectado por RT-PCR (Cambrón-Crisantos et al. 2019).

Lo anterior determina que los primeros estudios para identificar la presencia de ácidos nucleicos en las plantas que estaban presentando patologías con síntomas ya establecidos que podrían sugerir ser causadas por virus y viroides se basan en metodologías básicas las cuales van avanzando a lo largo de los años hasta convertirse en procedimientos rutinarios de gran utilidad y valor diagnóstico en el área de la investigación. Tras el total de publicaciones incluidas en la revisión sistemática en los dos periodos de veinte años analizados, se evidencia un aumento en la cantidad de información tanto en las temáticas de virus y/o viroides aislados en solanáceas en el país y Latinoamérica para el segundo periodo de tiempo estudiado, así como también en la cantidad de publicaciones relacionadas con métodos diagnósticos implementados para la detección de estos fitopatógenos.

Virus y viroides reportados en Colombia

De las 48 publicaciones analizadas durante el primer periodo de tiempo para este estudio, 23 publicaciones fueron aceptadas por los criterios de inclusión “Viroides reportados en solanáceas en Colombia”, “Virus reportados en solanáceas en Colombia”, de estas 19 publicaciones estudian virus y 4 estudian viroides, es decir que el estudio de viroides en este periodo de tiempo fue muy reducido y el diagnóstico de estas fitopatologías aún era bastante limitado (Figura 5).

Figura 5. Número de publicaciones de virus y viroides reportados en Colombia en el primer periodo de tiempo estudiado.

PSTV: Viroide tubérculo fusiforme de la papa; CEVd: Viroide citrus exocortis; ToMV: Virus del mosaico del tomate; TSWV: Virus del bronceado del tomate; PVY: Potato Virus Y; PVX: Potato Virus X; CTV: Virus de Ia Tristeza de los cítricos; TYLV: Virus del rizado amarillo del tomate; TMV: Virus del mosaico del tabaco;; CsCMV: Virus del mosaico común de la yuca; WClMV: Virus del mosaico del trébol blanco; NMV: Virus del mosaico de Narciso, PMV: Virus del mosaico de la papaya; CYMV: Virus del mosaico amarillo del trébol; FMV: Foxtail mosaic virus; SMYE: Virus del borde amarillo suave de la fresa; CPsV: Virus psorosis de los cítricos; CXD: viroide de la xiloporosis.

Por el contrario, se puede evidenciar el aumento en la cantidad de publicaciones en la base de datos del estudio para el segundo periodo de tiempo, fueron en este caso 68 publicaciones, de las cuales solo 4 incluyeron viroides aislados en solanáceas en Colombia, aunque sí existe información sobre estos patógenos sigue siendo es muy limitada en el país, el resto de artículos estudió 29 especies diferentes de virus en plantas (Figura 6).

Figura 6. Número de publicaciones de virus y viroides reportados en Colombia en el segundo periodo de tiempo estudiado.

PSTV: Viroide tubérculo fusiforme de la papa; PMTV: Virus del mosaico suave del tomate; TMMV: Virus del mosaico suave del tomate; ToYMV: Virus del mosaico amarillo del tomate; TSWV: Virus del bronceado del tomate; CMV: Virus del mosaico del pepino; PepDMV: Virus del mosaico deformante del pimenton; PYVV: Virus del amarillamiento de las nervaduras de la papa; PAMV: Virus del mosaico aucuba de la papa; AMV: Virus del mosaico de la alfalfa; PVY: Virus de la papa Potexvirus Y; PLRV: Virus del enrollamiento de la hoja de papa; ToRSV: Virus del anillado necrótico del tomate; PVS: Virus de la papa Potexvirus S; PVV: Virus de la papa Potexvirus V; ANSV: Virus de la estría necrótica de la Alstroemeria; PVA: Virus de la papa Potexvirus A; PVX: Virus de la papa Potexvirus X; TALMV: Virus de la malformación de la hoja de tamarillo; BPEV: alfaendornavirus del pimiento; STV: Virus del tomate del sur; TMV: Virus del mosaico del tabaco; TCDV: Viroide enano clorótico del tomate; MPV: Viroide de papita mexicana; TASV: Viroide apical del tomate; INSV: Virus de la mancha necrótica del impatiens; TRSV: Virus de la mancha anular del tabaco; PSMV: Virus del moteado severo de Physalis; TRV: virus del Crujido del Tabaco; TAMV: Virus del Mosaico del Tamarillo; TBSV: Virus del enanismo ramificado del tomate; TYLCV: Virus del rizado amarillo del tomate; APMV: Virus moteado andino.

En el primer periodo de tiempo los virus más aislados en el país fueron el virus de Ia Tristeza de los cítricos (CTV) y el virus psorosis de los cítricos (CPsV), el CTV reportado en tres publicaciones y el CPsV en dos publicaciones, mientras que solo se reportaron dos viroides: el viroide citrus exocortis (CEVd) en tres publicaciones y el viroide tubérculo fusiforme de la papa (PSTV) en una publicación, del total de veintitrés publicaciones que incluyen virus y/o viroides en Colombia. En el segundo periodo de tiempo los virus más aislados en el país fueron el Potexvirus Y (PVY) y el Virus del mosaico del pepino (CMV), el PVY reportado en diecisiete publicaciones y el CMV reportado en diez publicaciones, mientras que solo se reportaron cuatro viroides: Viroide tubérculo fusiforme de la papa (PSTV) dos publicaciones, el viroide enano clorótico del tomate (TCDV) en una publicación, el viroide de papita mexicana (MPV) en una publicación y el viroide apical del tomate (TASV) en una publicación, el del total de ciento diecisiete publicaciones que incluyen virus y/o viroides en Colombia. Como lo muestra la tabla 1 y 2 en los respectivos periodos de tiempo, donde los autores a lo largo de los años sumaron sus aportes para describir enfermedades ocasionadas por virus y por agentes menos conocidos como los viroides detallando sus mecanismos de acción, su agente hospedero y sintomatología entre otras características que son clave para su identificación.

Tabla 1. Agentes infecciosos descritos durante el año 1981 y 2000.

Tabla 2. Agentes infecciosos descritos durante el año 2001 y 2020.

La infección de estos fitopatógenos en su mayoría causa deformación del fruto y el follaje, el PVY causa mosaicos suaves a severos, acompañados con rugosidad en las hojas, enanismo, necrosis sistémica de las plantas y finalmente su defoliación, este virus es catalogado como el problema viral más limitante de los cultivos de solanáceas en el mundo, se estima que un cultivo infectado llega a reducir hasta en un 80% el rendimiento del cultivo (Henao-Díaz et al. 2013). Es por esto que se hace necesario la implementación de metodologías que apoyen el diagnóstico temprano de solanáceas infectadas con virus y/o viroides para disminuir las pérdidas por estos fitopatógenos.

Tras la revisión sistemática se encontró que en Colombia no hay los suficientes reportes de cultivos infectados por virus y/o viroides, lo cual se evidencia en las pocas publicaciones disponibles que fueron incluidas al estudio, esto con el fin de dar paso a futuras investigaciones que aporten a los agricultores quienes se encuentran preocupados por las afectaciones cada vez más agresivas en sus cultivos (Betancourth et al. 2020).

Conclusiones

Es de gran importancia el desarrollo de metodologías que ofrezcan herramientas de detección viral más precisas tanto a los productores de semilla, distribuidores de material de siembra, a los organismos de sanidad vegetal del país como a los mismos agricultores con el objetivo de comercializar semillas libres de patógenos virales y con el tiempo ampliar la información suministrada para su rápida detección, incluso que estas metodologías de detección y tratamiento puedan ser empleadas de forma rutinaria.

Este estudio brinda herramientas que van a permitir a futuros investigadores profundizar en este tipo de patologías tan comunes que afectan cultivos de importancia económica para pequeños y grandes productores tanto en Colombia como en Latinoamérica tomando como referencia el diagnóstico de dichos microorganismos. Incluso se trata de un medio por el cual lleva al replanteamiento de la importancia que se le debe dar al manejo de las fitopatologías.

Latinoamérica al ser una región tropical y tan extensa se caracteriza por la producción de cultivos en grandes masas, la investigación y el apoyo de los gobiernos de los países que la comprenden se encuentran en el gran desafío de búsqueda de mecanismos de prevención, diagnóstico temprano y tratamiento específico.

Agradecimientos

Nuestro sincero agradecimiento a todos los autores citados a continuación por su dedicación a los temas tratados, así como también a familiares y compañeros que nos otorgaron su contribución a lo largo del desarrollo del presente artículo.

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